本底“瘦身”计划：HCP ELISA开发记

ELISA背景介绍

      酶联免疫吸附实验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）是一种基于抗体-抗原-抗体特异性结合形成三明治复合物的高灵敏度、高特异性的免疫检测技术。鉴于其发展历史较久，技术积累成熟，且操作简便、成本较低、可高通量检测，广泛应用于医学（医疗器械和精密仪器）、生物学、药学、农业、食品安全等领域。根据使用应用的需要，可以分为直接法，间接法，夹心法和竞争法等。

      根据ELISA的特点，其常见应用有：病毒/细菌/寄生虫的定性检测，蛋白抗原定量，抗体效价和信号通路的定性和定量研究；药物研发与质量控制相关的血液和组织液中的药物定量，生物制品的效价测定等。

      ELISA的显著特点有：通过标准曲线，精确定量抗原分子浓度；定性筛查样本中目标抗原的存在与否；高通量检测大量样本；检测限度达到ng/mL，pg/mL的高灵敏度分析；以及抗原抗体特异性反应的亲和能力。

      其中，标准曲线是定量的最终依据，其主要体现的方面有：1.标曲是定量分析的核心依据，通过已知浓度标准品和对应的检测出信号，拟合成数学模型，来反算样本浓度；2.通过最低检测限和最低定量限，线性范围和重复性，来验证实验的可靠；3.根据斜率和截距判断独立实验的正常与否；数据可比性和标准化，来校正数据和减少批间差异。

       在ELISA检测中，Sum of Squares Error (SSE，误差平方和) 是数据分析的重要统计量，主要用于评估标准曲线拟合的准确性以及实验数据的离散程度。表示实际观测值（实验数据点）与拟合曲线（如标准曲线）预测值之间的偏差平方和。可以评估标准曲线的拟合优度，SSE越小，说明实际数据点与拟合曲线的偏差越小，曲线拟合效果越好，反之，提示此次实验模型不恰当；另外，在同一批次ELISA板中，不同标准曲线的SSE应接近，并结合R²等统计项目，来判断实验条件的重复性、可靠性和稳定性。见图1，图2。

ELISA Blank作用

      Blank孔不仅直接影响SSE的计算（校正OD=实测OD-Blank OD，Blank孔OD值不稳定或异常，会导致校正后的数据偏差增大，从而增加SSE，降低拟合精度。）；Blank孔的较大差异，会体现实验的系统误差；高Blank信号导致低浓度标准点的计量为负数，扭曲标准曲线，增大SSE。

      另外，在《酶联免疫吸附法检测试剂注册技术审查指导原则》，《定量检测试剂分析性能评估指导原则》，EP17-A2和《Immunoassay Devices Guidance for Industry》中，均提到定量检测中的Blank孔，明确要求ELISA实验需设置空白孔，并规定其信号应显著低于最低校准品信号（通常要求Blank OD≤最低校准品OD的50%）；或者要求空白孔用于确定检测限（LOD），其OD值需满足：均值+2SD≤低浓度校准品OD值；TMB显色时450nm波长下OD值一般≤0.1；强调空白孔的重复性（CV值应≤20%）等。

实际应用

      因为免疫实验的所有形式测量，都需要标准化。所以对Blank孔的控制是ELISA水平重要的具体体现之一。

      赛唐生物历时10年，在开发E.coli/CHO/293/SC Yeast/HS Yeast/PP Yeast HCP ELISA过程中，长期坚持打磨基础技术，对Blank本底进行了显著的控制，下降比例达10倍。并统计上百次实验数据，发现Blank从0.1，降低到0.05水平，再到0.01水平(见图3-图9)。

      与Cygnus相比，本底降低2-10倍，见表1，图10。为后续药物ELISA定量检测，提供了扎实的体系支持。

表1

参考标准

《酶联免疫吸附法检测试剂注册技术审查指导原则》

《定量检测试剂分析性能评估指导原则》

《EP17-A2: Evaluation of Detection Capability for Clinical Laboratory Measurement Procedures; Approved Guideline—Second Edition》

《Immunoassay Devices Guidance for Industry》

上海赛唐生物技术有限公司，专注于生物医药工业检测领域15年研发，推出HCP残留检测系列产品，以及HCP专属性抗体制备、覆盖度分析等全流程技术服务！

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